إعـــــــلان

تقليص
لا يوجد إعلان حتى الآن.

Polymerase Chain Reaction (PCR)

تقليص
X
 
  • تصفية - فلترة
  • الوقت
  • عرض
إلغاء تحديد الكل
مشاركات جديدة

  • Polymerase Chain Reaction (PCR)

    اعزائى سوف اقوم بشرح بعض التحاليل ونمط استخدامها فى صورة محاضرة مبسطة واريد من الجميع ان يقبلوا تحياتى
    Polymerase Chain Reaction (PCR
    )
    قوم فكرة تقنية ال PCR إلى القيام بتضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه والتى تمكننا من إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA أثناء الانقسام الخلوي.ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:

    1. البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة Oligonucleotides18 – 20 أساس آزوتي قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه، وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region
    2. كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين
    (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)
    3. أنظيم البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus.
    4. محاليل واقيه Buffers
    5. شوا رد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز.
    تتكون تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة:

    - مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف، أي فصل الطاق المزدوج ds-DNA إلى طاقين منفصلين ss-DNA. وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م .
    - مرحلة تشفع البادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الطاقين المنفصلين عند درجة حرارة 55م.
    - تطاول البادئات المتشفعة Annealed primers extension بمساعدة أنظم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 72 م.

    تعاد هذه الدورة ذات الخطوات الثلاثة عدداً من المرات، مما يؤدي إلى زيادة جزيئات DNA بشكل أساسى.
    ويعطى عامل التضخيم بالمعادلة التالية = n ( 1+E )x ، حيثn = الكمية البدئية للحمض النووي المقصود
    E = فعالية التضخيم (Efficiency)
    X = عدد دورات PCR
    يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من
    ComplementaryDNA(cDNA)DNA
    بواسطه انظيم الترنسكريتباز العكوسreverse tran******ase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.
    وتعرف هذه التقنيةRT-PCR

    يمكن الكشف عن منتجات التضخيم Amplicons بعدة طرق أهمها:

    1. الرحلان الكهربائي على هلامة الآغاروز Agarose Gel Electrophorsis .
    2. التهجين Hybridizationباستعمال مسابر موسومة بأنظيم Enzyme Labeled Probes
    3. استخدام بادئات موسومة بأنظيم أو مادة تألقية Enzyme Fluoresent Labeled Primers
    4. تقنية تعدد اشكال اطوال الشدف الحصريه
    RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
    5. التنسيل Cloning
    إن الحساسية العالية التي تبديها تقنية PCR، تجعلها عرضة لإعطاء نتائج إيجابية كاذبة بسبب تلوث خارجي المنشأ Contamination Exogenous. أهم مصادر هذا التلوث :
    5. التلوث بمنتجات تضخيم سابقة Carryover contamination
    6. التلوث من عينة أخرى Sample to sample contamination
    لذا يعتبر التلوث العقبة الوحيدة المهمة التي تواجه استخدام تقنية PCR لغايات تشخيصية. يمكن تجنب التلوث بالانتباه لتفاصيل العمل المخبري بتقنيةPCR .لذلك تم الاعتماد على تقسيم مكان العمل إلى ثلاثة أقسام منفصلة عن بعضها بشكل تام:
    1. قسم الاستنهاض Extraction sector
    2. قسم تحضير الكواشفReagent preparation sector
    وهذان القسمان يعرفان بــــPre – PCR sector
    3. قسم التضخيم والمعايرة Amplification + Detection sector
    ويعرف هذا القسم بــــ Post- PCR Sector
    هناك عدة تطبيقات لتقنية PCR : تداخلي Nested
    لا تماثلي Asymmetric
    تمايزي Differential

    لكن أهمها تطبيقان:

    1. PCR التنافسي (Competitive PCR)، ويشكل المبدأ الرئيسي للمقايسة الكمية باستخدام مرصاف خارجي المنشأ Exogenous template كعياري داخلي. حيث يتنافس هذا العياري الداخلي Internal Standard و الحمض النووي الهدف على البادئات ذاتها اثناء عملية التضخيم، ثم تجرى المقايسة الكمية للناتجين باستخدام طرق مختلفة.
    2.
    PCR سريع الدورة ذي الوقت الواقعي Rapid Cycle Real- Time PCR، حيث امكن اجراء عملية التضخيم بدورة حرارية مدتها 20 – 60 ثانية، كماامكن تحليل منتجات عملية التضخيم أثناء عملية التضخيم باستخدام صبغات تألقية.
    [
    الملفات المرفقة
    [الحمد لله كثيرا وسبحان الله بكره واصيلا لااله الا الله محمد رسول الله
    [](لله ما في السماوات وما في الأرض وإن تبدوا مافي أنفسكم أو تخفوه يحاسبكم به الله فيغفر لمن يشاء ويعذب من يشاء والله على كل شيء قدير ()

  • #2
    شكرا على الشرح الوافي

    تعليق


    • #3
      جزاك الله خير
      إن الحلم، الذي لا تستطيع أن تنزله من فضاء الخيال وتتحسسه ، وتحس به جزءا منك، وأنت جزء منه، سوف تضطر أن تصعد إليه.. لشئ واحد فقط..

      من أجل أن تهوي من عليائه فتتهشم...

      ثم تعود بعدها لتجمع حطامك..

      حطام قلبك المثخن بالخيبات..

      وحطام ذاكرتك الملأئ بالتجارب الفاشلة...

      أي قلب لك بعدها قادر على أن ينهض، يداوي جراحه.. يلملم حطامه ..
      _______________________________________________
      د. محمد الحضيف

      تعليق

      يعمل...
      X