إعـــــــلان

تقليص
لا يوجد إعلان حتى الآن.

dna electrophoresis

تقليص
X
 
  • تصفية - فلترة
  • الوقت
  • عرض
إلغاء تحديد الكل
مشاركات جديدة

  • dna electrophoresis

    السلام عليكم ورحمة الله

    لدي مشكلة عند إستخدام الإلكتروفوريسيس للـdna و عملت نفس الطريقة المذكورة في الأبحاث لكن ما تطلع معي أي نتيجه

    الفكرة إني أفصل منطقة معينة من الـdna بعد عمل تضخيم لها بواسطة الـpcr عند تحضير 2% من جل الأجاروز

    المشكلة إن الجهاز الي عندي كبير 2% من التحضيرة ما تغطي كل القالب ويطلع سمك الجل مره صغير
    لما ضاعفت الكمية وضعت 4جم من الأجاروز في 200مل من البفر ومشيت عليه العينات ماطلعت أي نتائج
    المشكلة الي محيرتني
    1- لما تمشي العينه على الجل (20ميكرو ليترمن الـdnaو 5ميكرو من الصبغه) يختفي لون الصبغه ولما أضع الجل على الuv لا أري أي باند.(فين راحت العينات؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟؟:sm169
    2-حتي الماركر يطلع مرة مغبش ومو واضح

    ولا أدري أين هي المشكلة
    ما الحل ؟؟:sm193:

    وشكرا

    وهذا رابط صورة الجهاز
    http://www.americaninstrument.com/eq...4B-ELECTRO.asp

    http://www.fishersci.com/wps/portal/...ll&fromSearch=
    التعديل الأخير تم بواسطة آخر الليل; الساعة 20-04-2008, 11:40 PM. سبب آخر: صورة الجهاز

  • #2
    اخي الكريم

    كيف فصلت العينه ما نيول ولا اوتوميتد؟؟؟

    كم طلع لك الــ O.D. بعد فصل الــ DNA

    يمكن انت محتاج يكون التركيز للجل عالي 2.5%

    او يمكن انت مخلي الفولت عالي و ما فرد معاك اللودر او الماركر بصوره جيده ..

    متى اضفت الإثيديم برومايد ؟؟

    تعليق


    • #3
      بالأضافة للاجابات السابقة
      1- هل تأكدت من خطوات PCR وذلك بوضع control positive
      2-هل نسبة Mg Cl2 مضبوطة
      3- ضع 20ميكرو ليترمن الصبغه و 5ميكرو من PCR product
      4- تركيز الجل يعتمد على حجم PCR product و عموما 1.5% مناسب مع Conventional PCR أما لو عملت RAPD-PCR or AP-PCR فيفضل 2.5%

      تعليق


      • #4
        تم فصل العينة مانيول بإستخدام كيت الكاياجين المعروف من عينة دم بكامل محتوياته
        تم عمل تضخيم للعينة بواسطة الـpcr الكيت المستخدم لنفس الشركة كاياجين ماستر مكس حيث يجب أن يكون مقاس المنطقة بعد التضخيم عند 372bp
        باستخدام 2% من جل الاجاروز حسب ماكتب في البيبر
        يتم إضافة الإيثيديوم برومايد قبل الصب بعد مايبرد الكمية التي أستخدمها 20ميكرو ليتر


        هل إشتغلتي أو تعرفي أحد إشتغل على نفس الجهاز بنفس المقاس المذكور ؟؟؟؟ فضلا لا أمرا
        أثناء بحثي وجدت طريقة تحضير جل لجهاز الهوفر ولكن لم أفهمها ممكن تشرحيلي إذا سمحتي

        تعليق


        • #5
          الرابط
          http://strawberrygenes.unh.edu/protocols.html

          تعليق


          • #6
            المشاركة الأصلية بواسطة hanaakader مشاهدة المشاركة
            بالأضافة للاجابات السابقة
            1- هل تأكدت من خطوات PCR وذلك بوضع control positive
            عملت هذه الخطوة ولم تظهر باند بل ظهر كتله غير واضحه والعينة فاشه في الجل:sm184::sm204:

            2-هل نسبة Mg Cl2 مضبوطة[/QUOTE]
            ما هي النسبة المضبوطة؟؟؟؟لم أفهم:sm184: هناك عدة طرق ماهي الطريقة التي تتبهينها ممكن أن تذكري خطواتها

            3- ضع 20ميكرو ليترمن الصبغه و 5ميكرو من PCR product[/QUOTE]
            من المتعارف عليه أن نضع مقابل كل 5ميكرو من الدي إن أي 1ميكرو من الداي أو الصبغة
            وأنا أضع 20 ميكرو من الدي إن إي مع 5من الصبغة:sm184:

            4- تركيز الجل يعتمد على حجم PCR product و عموما 1.5% مناسب مع Conventional PCR أما لو عملت RAPD-PCR or AP-PCR فيفضل 2.5%[/QUOTE]
            أنا أستخدم حسب ما ذكر في البيبر:sm206: وجميعها إتفقت على 2% من الجل
            أما بعد القص من2-2.5% على حسب الsnp


            ماذا تقترحين علي فعله في هذه الحالة لو كانت لديك طريقة تحضير على نفس الجهاز الموجود في الرابط فضلا لآ أمرا أن تشاركينا فيها للإستفادة العامة:sm182:

            تعليق


            • #7
              الجهاز عندى هو submarine mini gel و انا استخدمه كالاتى: تركيز 1% و احصل على bands من 200-2000 bp
              1- يتم وزن 0.4 جم من الاجارو مع 40 ملل فى قارورة 100 ملل
              2- اضع القارورة فى الميكروويف لمدة 50-60 ثانية
              3- انتظر حتى تبرد المحتويات حتى 55 درجة مئوية تقريبا
              4- اضع 0.1 من صبغة ethedium bromide تركيز 10 مكروجرام / ملل
              5- تحضير الجهاز و وضع المشط ثم صب الاجاروز و تركه حتى يبرد

              بالنسبة لعدم ظهور باند بل ظهر كتله غير واضحه ----- هذا ما يسمى smear و يمكن يكون نتيجة لعدم الاستخلاص الجيد DNA و وجود بروتين . اعد خطوة protein removal
              نسبة Mg Cl2 تذكر فى reference
              for sample dye اضع 1-2 ملل من PCR product مع 5 ملل صبغة

              تعليق


              • #8
                لو بتستخدم كياجين لاستخلاص DNAمن الدم انا استخدمتها
                1-تاكد من خطوات الاستخلاص وPCR
                2-انا استخدمت 2%جل, ايثديم 2ميكرون
                3-ضيف 3 ميكرون (DYE)
                +7ميكرون PRODUCT
                4-تاكد من ظبط الفولت والامبير
                انا حضرت 1 جرام جل على 50 من WOKING BUFFER

                تعليق

                يعمل...
                X