صفحة 1 من 3 123 الأخيرةالأخيرة
النتائج 1 إلى 10 من 22

الموضوع: من يحب يتعلم ماهو الPCR

  1. #1
    تاريخ التسجيل
    Jan 2008
    الدولة
    Palestine
    المشاركات
    176

    Lightbulb من يحب يتعلم ماهو الPCR

    المقدمة

    تحفظ المعلومات الوراثية و انتاج المواد لصنع الخلايا و الحفاظ عليها في داخل الحمض النووي (DNA ) . و تقوم الخلية بمضاعفة كمية الحمض النووي وقت انقسام الخلية بشكل تلقائي و بشكل سريع مع وجود نظام تصحيح للأخطاء خلال النسخ. . و تبلغ سرعة النسخ والمضاعفة إلى 1000 قاعدة نيتروجينية بالثانية ( داخل النظام الحيوي ) و هي كما ذكرنا تحدث في الخلية في وقت التكاثر والانقسام فقط .
    ومع التطور في مجال التكنولوجيا الحيوية والذي يقوم على التعامل مع الحمض النووي (DNA ) بشكل أساسي ، استدعى ذلك العلماء على أن يبحثوا عن طريقة أو تقنية تقوم على مضاعفة كمية الحمض النووي (DNA ) بشكل كبير ، فكان هناك عدة محاولات لتنشيط الخلية على الانقسام المستمر بإضافة عوامل النمو growth factors ، ولكن هذه الطريقة لم تكن ذات جده لدى العلماء لأسباب كثيرة. إلى أن توصل العالم د. كري مولس Dr. Kerry Mullis في عام 1985 ( و قد حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993)بنشر اختراعه لتقنية البي سي ار PCR فكانت هذه التقنية بوابة لكثير من التطورات المتسارعة في مجال التكنولوجيا الحيوية ، من أهم الأسباب التي ساعدت هذه التقنية على الانتشار عدم اعتمادها على النظام الحيوي(أي الخلية) و التحكم بكمية الحمض النووي (DNA ) و وسرعة في الإنتاج ولكن كان من عيوب هذه التقنية عدم وجود نظام إصلاح أخطاء الارتباط الخاطئ miss match .

    ما هو PCR :

    هو تقنية مخبريه تم اكتشافها عام 1983م تقريباً تقوم على إكثار نسخ الحمض النووي (DNA ) خارج النظام الحيوي . أي أنها طريقة لنسخ الحمض النووي في المختبر. و لذلك فهي تقنية حيوية لاستنساخ قطعة من محددة من الحمض النووي و مضاعفة إنتاجها لكي يتسنى إجراء عليه اختبارات و فحوصات إضافية. تفاعل البوليمراز السلسليPolymerase Chain Reaction (PCR)
    تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA أثناء الانقسام الخلوي.ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:
    .1 البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي) قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه، وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region .
    .2 كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين
    (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)
    .3 أنزيم البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus.

    .4محاليل واقيه Buffers
    .5 شوا رد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز.

    تتألف تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة:
    • مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف، أي فصل الطاق المزدوج ds-DNA إلى طاقين منفصلين ss-DNA. وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م .
    • مرحلة تشفع البادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الطاقين المنفصلين عند درجة حرارة 55م
    • تطاول البادئات المتشفعة Annealed primers extension بمساعدة أنظم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 72 م.
    تعاد هذه الدورة ذات الخطوات الثلاثة عدداً من المرات، مما يؤدي إلى زيادة جزيئات DNA بشكل أسي.
    ويعطى عامل التضخيم بالمعادلة التالية = n ( 1+E )x ، حيثn = الكمية البدئية للحمض النووي الهدف
    E = فعالية التضخيم ( (Efficiency
    X = عدد دورات PCR
    يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من
    ComplementaryDNA(cDNA)DNA
    بواسطه انزيم الترنسكريتباز العكوسreverse transcriptase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.
    وتعرف هذه التقنيةRT-PCR
    يمكن الكشف عن منتجات التضخيم Amplicons بعدة طرق أهمها:

    .1 الرحلان الكهربائي على هلامة الآغاروز Agarose Gel Electrophorsis .

    .2 التهجين Hybridizationباستعمال مسابر موسومة بأنظيم Enzyme Labeled Probes

    .3 استخدام بادئات موسومة بأنزيم أو مادة تألقية Enzyme Fluoresent Labeled Primers

    .4 تقنية تعدد اشكال اطوال الشدف الحصريه
    (RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism

    .5التنسيل Cloning
    إن الحساسية العالية التي تبديها تقنية PCR، تجعلها عرضة لإعطاء نتائج إيجابية كاذبة بسبب تلوث خارجي المنشأ Contamination Exogenous.

    أهم مصادر هذا التلوث :
    .1 التلوث بمنتجات تضخيم سابقة Carryover contamination
    .2 التلوث من عينة أخرى Sample to sample contamination
    لذا يعتبر التلوث العقبة الوحيدة المهمة التي تواجه استخدام تقنية PCR لغايات تشخيصية. يمكن تجنب التلوث بالانتباه لتفاصيل العمل المخبري بتقنيةPCR .لذلك تم الاعتماد على تقسيم مكان العمل إلى ثلاثة أقسام منفصلة عن بعضها بشكل تام:
    .1 قسم الاستنهاض Extraction sector
    .2 قسم تحضير الكواشفReagent preparation sector
    ) وهذان القسمان يعرفان بــــPre – PCR sector)
    .3 قسم التضخيم والمعايرة Amplification + Detection sector
    (ويعرف هذا القسم بــــ Post- PCR Sector )
    هناك عدة تطبيقات لتقنية PCR : تداخلي Nested
    لا تماثلي Asymmetric
    تمايزي Differential

    لكن أهمها تطبيقان:

    .1 PCR التنافسي (Competitive PCR)، ويشكل المبدأ الرئيسي للمقايسة الكمية باستخدام مرصاف خارجي المنشأ Exogenous template كعياري داخلي. حيث يتنافس هذا العياري الداخلي Internal Standard و الحمض النووي الهدف على البادئات ذاتها اثناء عملية التضخيم، ثم تجرى المقايسة الكمية للناتجين باستخدام طرق مختلفة.
    .2 PCR سريع الدورة ذي الوقت الواقعي Rapid Cycle Real- Time PCR، حيث امكن اجراء عملية التضخيم بدورة حرارية مدتها 20 – 60 ثانية، كماامكن تحليل منتجات عملية التضخيم أثناء عملية التضخيم باستخدام صبغات تألقية.

    التطبيقات السريرية لتقنية PCR :

    .1 الكشف المباشر للعامل الخمجي الممرض (جرثومي – فيروسي – طفيلي... ) قبل ارتكاس الجهاز المناعي لهذا العامل (إنتاج الأضداد). في الماضي، يتم الكشف عن العامل الممرض بشكل غير مباشر عن طريق كشف/ معايرة الأضداد:
    - إيجابية كاذبة ← أضداد غير نوعية
    - سلبية كاذبة ← تأخر ظهور / إنتاج الأضداد لأسباب مناعية.
    وبشكل مباشر عن طريق الزرع ← صعوبة زرع الفيروسات
    طول فترة الزرع كمال هي الحال في عصيات السل

    .2 تحديد الحمل الفيروسي Viral Load وتحديد إمكانية المعالجة أم لا

    .3مراقبة وتقييم المعالجة :
    PCR y ← استجابة
    PCR Å ← عدم استجابة ← خطة علاجية جديدة
    PCR y ثم Å في فترة المعالجة ← Break Through ← خطة علاجية جديدة
    PCR y ثم Å بعد انتهاء المعالجة ← نكس
    .4 تحديد الأنماط الجينية Genotyping للفيروس الكبدي C
    .5 الأمراض الوراثية : أ – كشف الأساس الجيني للمرض الوراثي عند الكاهل، ومعرفة الحاملين والمصابين ومن ثم المشورة الوراثية الصحيحة
    ب – الكشف عنها قبل ظهور الأعراض والعلامات
    ج – الكشف عنها عند الجنين أثناء الحمل، أو في حديثي الولادة
    .6 تشخيص الأمراض السرطانية بالكشف الجيني للتوضع الغير طبيعي للأسس الآزوتية للجينات الورميه Oncogenes
    .7 تعيين الأنماط النسيجية HLA- tissuc typing في مجال زراعة الأعضاء
    .8 تلعب تقنية PCR دوراً هاماً في الطب الجنائي والشرعي.
    أخيراً وليس أخرا، كانت تقنية PCR تستخدم في تسعينيات القرن الماضي كاختبارات استقصائية متممة، ولكن في نهاية القرن العشرين بدأت هذه التقنية تحل محل تقنيات كثيرة أخرى لأنها أثبتت فعالية كبيرة ودقة ممتازة.
    وفي مطلع القرن الواحد والعشرين وبعد إتمام سلسلة الجينوم البشري، أصبح ينظر إلى كامل هذا القرن بأنه قرن الجينوميات Genomics وسيكون لتقنيةPCR دوراً أساسياً في هذه الثورة العلمية الكبرى.

    ما هي متطلباتPCR :
    لتقوم بإنتاج الحمض النووي (DNA ) بواسطة PCR يتتطلب عليك توفير :
    1. جهاز للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشمل دقيق و متتالي ( الدورة الحرارية Thermocycle ) : ويقوم هذا الجهاز بتغير درجة الحرارة بشكل سريع ، لآن تغير درجة الحرارة هو الأساس الذي تقوم عليه فكرة هذه التقنية .
    2. البليمريز : وهو الإنزيم الذي يقوم ببناء وترتيب القواعد النيتروجينية ( حدات الحمض النووي (DNA ) ) ، ويجب أن يكون هذا الإنزيم مقاوم للحرارة العالية ليتمكن من العمل . و قد اكتشف انزيم مقاوم للحرارة و اسم تاج Tag
    3. مجموعة متفرقة من القواعد النيتروجينية: ( A T C G ) ليتمكن الإنزيم من ترتيبها في مواقعها أثناء عملية نسخ الحمض النووي (DNA) .
    4. بريمر Primer : وهو قطعة صغيرة من الحمض النووي (DNA ) ليتمكن الإنزيم من بداء البناء و النسخ عليها .
    5. والشيء الأهم هو وجود نسخة من الحمض النووي (DNA ) المراد نسخه .
    6. بالإضافة إلى محلول أو وسط ليتم به التفاعل : وهذا المحلول يختلف بين تفاعل و أخر .
    عملية النسخ :
    بعد وضع الحمض النووي المراد نسخة مع البريمر و و إنزيم البوليمريز و مجموعة مع الأحماض النووية في أنبوب داخل جهاز التحكم الحراري فان هناك 3 مراحل منفصلة تمر بها عملية النسخ:
    1. مرحلة التفكيك Denature : رفع الحرارة إلى 94 ْم وذلك لفك الحمض النووي (DNA ) الأصل .
    2. مرحلة الالتصاق anneal : إنزال الحرارة إلى ما بين 55-60 ْم ليقوم البريمر بالألتزاق فيزيائياً بواسطة الروابط الهيدروجينية مع الحمض النووي (DNA ) الأصل .
    3. مرحلة الامتداد extend : ثم يقوم برفع درجة الحرارة إلى 75 ْم ليقوم البلمريز بعمله في بناء الحمض النووي (DNA ) الجديد .
    وهذه المراحل الثلاث تعتبر دورة كاملة وفيها يصبح الحمض النووي (DNA ) الأصل قد تضاعف ، وتعتمد كمية ناتج الحمض النووي (DNA ) على عدد الدورات ( والصورة التالية توضح العملية ) .
    لمشاهدة هذه العملية اضغط على هنا.
    تطبيقات PCR :
    لتقنية PCR تطبيقات كثيرة في مجال أبحاث الحمض النووي (DNA) و الوراثة ومنها :
    1. الكشف عن الطفرات الوراثية : وذلك عن طريق وضع بريمر خاص للطفرة لتكثير الجين الخاص بها . ومنه نقوم بمعرفة المرض إذا كان على زوجين الكروموسومات أو على احدهما ( allele ) .
    2. تعين البصمة الوراثية .
    3. الكشف عن الفيروسات : وهذه الطريق هي الأدق في تحديد نوع وجنس الفيروس وكميته.
    4. هو العنصر الأهم في عملية التجميع الجيني ( Recombinant الحمض النووي (DNA ) ) : حيث نقوم بتكثير الجين المراد إدخاله على البلازمد أو الحمض النووي (DNA ) المضيف .
    5. استخدامه في تغير نهايات الجين لتصبح متوافقة مع إنزيمات القطع ( Restriction enzyme ) .
    6. هو العملية الأساس في تحديد تتابع القواعد النيتروجينية في الحمض النووي (DNA ) ( الحمض النووي (DNA ) Sequencer) .
    7. معرفة طول الحمض النووي (DNA ) .
    8. تقنية الحمض النووي (DNA ) المكمل ( cالحمض النووي (DNA)) .
    9. تحديد الجين المطلوب من خليط من الجينات .
    10. يستخدم في تقنية (microarrays ).
    11. في مشروع الخارطة الجينية البشرية (human genome project ) .
    12. الساوثرين بلوت (southern plot ) .
    13. تقنية ارتباط الحمض النووي (DNA ) – بروتين ( الحمض النووي (DNA ) -Protein Interaction ) .
    14. في مجال الطب الشرعي ( اختبار الأمومة ، حالات الاغتصاب ، تحديد الهوية ... الخ ) .
    وغيرها من التطبيقات المخبرية والبحثية .
    أنواع PCR : هناك نوعان من PCR :
    1. PCR العادي : وهو ما تم شرحه والتطرق اليه في الخطوات السابقة .
    2. rtPCR : وهو اختصار لـ ( Real Time PCR ) : وهذا النوع يقوم على نفس المبدأ ولكن الخلاف الوحيد يكون مربتط الجهاز بكمبيوتر لتحديد الوقت الحقيقي لبدا التفاعل ومن ثم الكمية الحقيقية لعدد نسخ الحمض النووي (DNA ) ويعتمد ذلك على وجود قواعد نيتروجينية حرة مشعة لتحديد ذلك . مما يسهل على الباحثين الوقت لتحدد وجود الجين المطلوب أو لا ، وكمية الجين بدون الوصول إلى نهاية الدورات الحرارية المحددة
    Samy Khwiter
    Biomedical Lecturer

  2. 2 أعضاء قالوا شكراً لـ Kh. Samy على المشاركة المفيدة:

    مدين الحكيمي (18-03-2010), ALABDI (23-10-2010)

  3. #2
    تاريخ التسجيل
    Jan 2008
    الدولة
    Palestine
    المشاركات
    176
    انشاللة يعجبكم هالموضوع اخوكم سامى حسن
    Samy Khwiter
    Biomedical Lecturer

  4. #3
    تاريخ التسجيل
    Jun 2007
    الدولة
    المدينه المنورة
    المشاركات
    867
    الله يعطيك العافية يا غالي , على الموضوع الجميل ..

  5. #4
    تاريخ التسجيل
    Apr 2009
    الدولة
    مصر
    المشاركات
    97
    جزاك الله خيرا:sm189::sm189:

  6. #5
    تاريخ التسجيل
    May 2007
    الدولة
    الاسكندريه
    المشاركات
    154
    ممتاااااااااااااااااااز واحسنت صنعا

  7. #6
    تاريخ التسجيل
    Nov 2008
    الدولة
    سوريا
    المشاركات
    1,236

  8. #7
    تاريخ التسجيل
    Aug 2009
    الدولة
    مصر
    المشاركات
    1
    هو انت درست ل احمد رافت ولا اية

  9. #8
    تاريخ التسجيل
    Aug 2009
    الدولة
    بغداد
    المشاركات
    10
    الف شكرا الك ع الموضــــــــــــوع الرائع
    تحيـــــــــــاتي

  10. #9
    تاريخ التسجيل
    Jan 2009
    الدولة
    جده
    المشاركات
    31
    مشكور
    جزاك الله خير

  11. #10
    تاريخ التسجيل
    Aug 2009
    الدولة
    مصر
    المشاركات
    31

    جميل جدا بارك الله فيك

صفحة 1 من 3 123 الأخيرةالأخيرة

معلومات الموضوع

الأعضاء الذين يشاهدون هذا الموضوع

الذين يشاهدون الموضوع الآن: 1 (0 من الأعضاء و 1 زائر)

ضوابط المشاركة

  • لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
  • لا تستطيع الرد على المواضيع
  • لا تستطيع إرفاق ملفات
  • لا تستطيع تعديل مشاركاتك
  •  
vBulletin skin developed by VillaARTS.