إلي اشتغل بنفسه تجربةالـRFLP-PCR

[آخر الليل]

السلام عليكم :sm170:

يا ريت:sm182: أحد قد إشتغل شغل الـPCR بنفسه يقدر ينصحني إيش الخطوات التي يجب إتباعها
حيث أني طالب مبتدئ :sm205:


وعندي سؤال
تجربتي إني أقوم بقص منطقة معينه من الجين بواسطة إنزيم قطع محدد
وعشان أطلب الانزيم من معامل كبيرة لازم أعرف الكمية إلي أحتاجها طوال التجربة
السؤال
كم الكمية التي تلزمني لأداء التجربة على 250عينة DNA
:sm193::sm193::sm193::sm193:

[الاخصائي أبوفهد]

وانا مع الاخ/ راعي ياليت اللي يعرف يطرح تجاربها العلميه والعمليه

وشكرا

[آخر الليل]

مشكور على مرورك

[الواقع والحياد]

السلام عليكم

يا ريت أحد قد إشتغل شغل الـPCR بنفسه يقدر ينصحني إيش الخطوات التي يجب إتباعها
حيث أني طالب مبتدئ


وعندي سؤال
تجربتي إني أقوم بقص منطقة معينه من الجين بواسطة إنزيم قطع محدد
وعشان أطلب الانزيم من معامل كبيرة لازم أعرف الكمية إلي أحتاجها طوال التجربة
السؤال
كم الكمية التي تلزمني لأداء التجربة على 250عينة DNA

عشان أعطيك الطريقة و العمل يهمني أعرف وش نوع العينه و الطريقة اللي راح تستخدمها و المحاليل و نوعيتها عشان أجيب لك البرتوكول كامل و منها نحسب لعينه وحده كم راح تحتاج و تكلفنا و نضربها بــ 250 عينة ...

[آخر الليل]

شكرا على إقبالك لمساعدتي يا أخت الواقع والحياد
أنا الآن في مرحلة تجميع العينات وإستخلاص الـdna من عينات دم بكامل محتواها بواسطة كيت واسمهQIA amp DNA Blood kitلشركة كاياجين.
وأريد جدول أمشي عليه بعون الله يساعدني في تنظيم وقتي وتركيز جهدي و تطلع النتائج بشكل مشرف وهذي الخطوة محد يقدر يساعدني فسها إلا متخصص أو تقني إشتغل بيده.

شغلي يتطلب الكشف عن وجود snp في جين معين بإستخدام تقنيةRFLP-PCR
الأجهزة التي سوف أستخدمها:
جهازTHERMO CYCLER
وجهاز الإلكتروفوريسيس الافقي(جهاز الترحيل الكهربائي) بإستخدام جل الأجاروز.

طبعا توجد KIT خاصه لكل مرحلة لكن المهارة تكمن في تحديد الكمية الملائمة لاداء التجربة بحيث يتم صرفها بالكامل
لأنه كما تعلمين غلاء هذه المواد الفاحش بحيث ترهق كل من أراد التخصص في هذا المجال.

الKIT الثاني الذي سوف أستخدمه إن شاء الله في جهاز الPCR هوHOT STAR TAQ MASTER MIX KIT لشركة كاياجين
وهنا تكمن الأسئلة:
ماهو البرايمر ,وكم الكمية الازمة لإجراء التجربة على250 عينة ؟
كما أريد فهم واضح للكيت بالعربي وذلك لأن دراستي كلها كانت بالعربي وأجد صعوبة بالغة في الفهم والإستيعاب باللغة الإنجليزية؟
ماهي الاجرائات التي يجب أن أتبعها لأداء التجربة بشكل سليم؟
كما أنه قيل لي بوجوب تعقيم جميع الأدوات التي أستخدمها بالاتوكليف ولكن عند تعقيمي لها ساحت جميع الأدوات لأنها بلاستيكية ؟؟؟!!!!

حتى أسهل الموضوع أنت الآن تتعاملي مع مبتدئ لايفهم شيئا

وأطلب الإذن من كل من أراد مساعدتي ولديه الوقت أن يكون إستاذي خطوة بخطوة؟

وأن يستحمل إستفساراتي

وإني والله وجت من هذا الموقع منبر رائع لكل من أراد أن يتعلم فجزى الله خيرا لكل من مد يد المساعدة ونفع الله به الأمة

[آخر الليل]

هل من منقذ
كيف أحضر2% من جل الأجاروز؟؟؟؟

[الواقع والحياد]

http://abe.leeward.hawaii.edu/Protoc...rophoresis.htm

http://fp.bio.utk.edu/mycology/Techn...arose_gels.htm

العملي :

http://weather.nmsu.edu/Teaching_Mat...s/agarose.html

http://troi.cc.rochester.edu/~wolb/F...rophoresis.doc

[آخر الليل]

بارك الله فيك ولكن عندي سؤال
كم درجة الحرارة التي أضبط بها الميكرويف وكم دقيقة يحتاج لكي يذوب بالكامل
قالوا لي ممكن يفرقع الجل داخل الميكرويف

[الواقع والحياد]

بالنسبه لتحضير حضر في flask و حاول انه يكون كبير لانه احيانا اذا وصل مرحلة الغليان ممكن يطلع برى الــ flask



و الميكرويف هو اصلا مضبوطه درجة الحرارة فيه ... عني شخصيا اضبط الوقت بالعاده اخليه دقيقه و اشوف هل اكتمل الذوبان ولا لأ . طبعا تبي نعرف لانه يتحول المحلول من عكر الى صافي مثل الماء و اذا حسيت انه لا ارجع ازود دقيقه ثانيه

نقطه ثانيه حبيت اذكرها هو انك تحط الايثيديم برومايد بعد هالخطوة لانه فيه ناس تحطها قبل عشان ما تطلع ابخره و خصوصا انه مسرطن فمهم جدا ... انتبه و انت تتعامل معاه و القفازات مهمه جدا ...

لا تنسى تستعمل قطعة المطاط لما تطلع الفلاسك من الميكرويف عشان حرارة الزجاج ما تحرق يدك.

[آخر الليل]

كلام مفهوم وواضح تسلمين
كمان هناك عدة أنواع من الأجاروز ,أيهما يفضل في هذه التجربة؟؟؟
بالنسبة للبرايمر...
F: 5'- TAG AAG TAG ACT CTG CTG AGA TG-3

R:5'- CTC CCT GTG TCT AGG CCT TAG-3
ماذا يعنى5نانومول وهل الكمية تكفي ل250عينة؟؟؟

[آخر الليل]

همممممممممم محد جاوبني أنا محتار جدا
أنقذوني

كيف نجعل الباند أكثر وضوحا في الإلكتروفوريسيس؟؟؟؟

[الواقع والحياد]

أخي آخر الليل ارجع لهذين الموقعين و اطرح جميع اسئلتك

BioTechniques® Molecular Biology Techniques Forums

http://molecularbiology.forums.biote...6b91e09d1312ce

----------------------------------------------------------------------------------------------

و الثاني

http://www.protocol-online.org/forums/index.php?act=idx

---------------------------------------------------------------------------------------------

[antivirus]

لدي تساؤل للأخ أخر الليل وهو:
قولك بأنك تعمل على استخلاص ال DNA من الدم مع العلم أن كريات الدم الحمراءلاتحتوي علي نواة وبذلك يكون من الاستحالة استخراج ال DNA منها !!!!!!!!!!!!!!!!!! أرجو الرد على تساؤلي

[الواقع والحياد]

سأجيب مؤقتا إلى أن يجيب الاخ آخر الليل ...

عنما نذكر ان العينه هي دم Blood sample فهذا يعني احتوائها على كريات الدم البيضاء و هي التي سوف يتم استخلاص DNA منها ... و سيتم تكسير الخلايا الحمراء للتخلص منها ...

[antivirus]

مشكووووووووووووورة على الرد السريع