تويت
•خطوات الكشف الكيفي (النوعي) عن الفيروس الكبدي سي بإستخدام تقنية( PCR)باستخدام كاشف
COBAS®AMPLICOR®HCV QUALITATIVE Test,version 2.O
يجرى هذا التحليل للتأكد من وجود الفيروس في مصل المريض حيث يتم الكشف عن وجود الحامض النووي للفيروس سي (RNA) باستخدام تقنية
( PCR) باستخدام كاشف
COBAS®AMPLICOR®HCV QUALITATIVE Test,version 2.O من شركة ROCH"", ويختبر الكاشف 96 عينة .
نوع العينات المستخدمة:
يستخدم لإجراء هذا الإختبار عينات مصل الدم وبلازما الدم.
محتويات الكاشف:
•كواشف تحضير العينات وتحتوي على:
1)محلول تحليل الخلايا( LYS) ((HCV Lysis Reagent.
2)الكونترول الداخلي للعينات (IC)HCV Internal Control) ).
3)مخفف الحمض النووي الفيروسي((HCV-DIL ((HCV-RNA Diluent .
•كواشف الكونترولات وتحتوي على:
1)كونترول ايجابي وكونترول سلبي للفيروس الكبدي سيHCV Controls) (CTL)).
2)محلول سلبي لبلازما الدم ( NHP) (Negative Human Plasma).
•كواشف التكبير وتحتوي على:
1)مخلوط السيادة لإختبارالحمض النووي الفيروسي(HCV-Master Mix)( MMX) .
2)أيونات المنجنيز (Mn+2) المحفزة لتفاعل (PCR) .
•كواشف الكشف عن نواتج التكبيرللفيروس وتحتوي على :
1)محلول (CX PS1) 1) (HCV Probe Suspension .
2)محلول (CX4) 2) HCV Probe Suspension) .
•كواشف الكشف عن نواتج التكبيرالخاصة بجهاز
COBAS®AMPLICOR® وتحتوي على:
1)محلول تفكيك الحامض النووي (Denaturation Solution) (DN4).
2)محلول المتلازم الإنزيمي Congugate Detection Reagent) (CN4) ).
3)محلول الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي(Substrate) (SB3) .
4)محلول الغسيل الخاص بجهاز COBAS®AMPLICOR®:
(WB)Washing Buffer) ).
اللوازم والمواد المستخدمة في الإختبار والغير متوفرة في الكاشف:
1)كحول الإيثانول بتركيز 70%.
2)كحول الإيزوبروبانول بتركيز 100%.
3)ورقة عمل (Work Sheet) المخصصه لاختبار (.(HCV qualitative
الأدوات الملحقة بالجهاز واللازمة لإجراءالإختبار:
1)حلقات الأنابيب (A-RING) وتحتوي على 12 أنبوبة متراصة بشكل دائري سعة الواحدة منها 100µ لزوم تكبير الحامض النووي.
2)حوامل أنابيب (D-CUPS) تحتوي على عدد 70 انبوبة سعة 2 مل متراصه في خمسة صفوف متوازيه في كل صف 14 أنبوبة لزوم الكشف عن الحامض النووي المكبر.
3)حوامل الكواشف ( Reagent Cassette) وهي خاصة لوضع المحاليل داخل الجهاز.
التحضيرات :
•تحضير مخلوط السيادة لإختبار الحمض النووي الفيروسي
Master Mix) Working)
1.يضاف 100µ من HCV (Mn+2) الى عبوة HCV ( MMX) ثم يرج الخليط جيدا بواسطة الهزاز(Vortex) ويحفظ عند درجة حرارة من(2˚- 8˚م) لإستخدامة خلال 4 ساعات فقط من التحضير.
2.يضاف 50µ من (Working M.mix) الى أنابيب (A-RING) وتحفظ عند درجة حرارة (2˚- 8˚م) قبل ادخالها في الجهاز لإتمام عملية تكبير الحامض النووي الفيروسي Amplification) ).
•تحضير محلول تحليل الخلايا Working Lysis Reagent))
يضاف 100µ من HCV(IC) الى عبوة من ( HCV( LYS ثم يرج الخليط جيدا بواسطة الهزاز ويحفظ عند درجة حرارة الغرفة من (20˚ - 25˚م) لإستخدامة خلال 8 ساعات فقط من التحضير.
•تحضير محلول الغسيل الخاص بالجهاز (WB)Washing Buffer))
يضاف500 مل من محلول الغسيل المركز (WB) الى 4500 مل من الماء المقطر المتأين (Deionised Distal Water) ثم يوضع المحلول المحضرفي الحاوية المخصصة له والملحقه بالجهاز .
خطوات اجراء الإختبار:
1.تسجيل الكونترولات, كونترول سلبي ثم كونترول ايجابي ثم العينات الأولى فالثانية حسب الترتيب على ورقة العمل الخاصه بلإختبار.
2.ترقم أنابيب الإختبار سعة 1,5 مل بعدد العينات المراد فحصها مع اضافة أنبوبة للكونترول الإيجابي وأنبوبة للكونترول السلبي.
3.يضاف 400µ من مخلوط السيادة لإختبار الحمض النووي الفيروسي.
(Working Lysis Solution) المحضر الى الأنابيب المرقمة ابتداء بالكونترول السلبي ثم الكونترول الإيجابي ثم العينة الأولى فالثانية ......الخ مع مراعاة تعليم الأنابيب.
4.تضاف 200µ من كل عينة الى الأنبوبة المرقمة برقم العينة ابتداء بالعينة الأولى وانتهاء بالعينة الأخيرة مع عمل مزج خفيف بواسطة الماصة.
5.يضاف 200µ من المحلول المعادل لبلازما الدم NHP)) لأنابيب الكونترولات فقط.
6.يضاف 20µ من الكونترولات السالبة والموجبة في الأنابيب المخصصة لها.
7.تحضن جميع الأنابيب عند درجة حرارة 60˚م في سخان جاف لمدة عشرة دقائق.
8.يضاف 600µ من كحول الإيزوبروبانول 100% لجميع العينات والكونترولات ثم ترج بواسطة الهزاز(Vortex) لمدة 10 ثواني.
9.توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي على سرعة 12500rpm ولمدة 15 دقيقة مع مراعاة أن تكون جهة الأنابيب المعلمه للخارج.
10.تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى الحامل المخصص ثم يتم التخلص من الكحول بحرص شديد بعيدا عن الجهة المعلمة باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
11.يضاف 1000µ من كحول الإيثانول 70% لجميع العينات والكونترولات ثم ترج الأنابيب جيداً باليد.
12.توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي على سرعة 12500rpm لمدة 5 دقائق مع مراعاة أن تكون جهة الأنابيب المعلمه للخارج.
13.تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى الحامل المخصص ثم يتم التخلص من الكحول بحرص شديد بعيدا عن الجهة المعلمة باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
14.يضاف 200µ من مخفف الحمض النووي الفيروسي HCV(DIL) على الراسب المتجمع في أسفل الأنبوب (Pellet) ثم يتم مزج وخلط المحلول قدرالمستطاع لتكسير(Pellet) والحصول على معلق متجانس من الحمض النووي.
15.يؤخذ 50µ من معلق الحمض النووي لكل عينة بعد مزجه جيدا ويضاف الى (Working M.mix) المحضر الموجود في الأنابيب المخصصة للعينات في الحلقة A-RING)) مع مراعاة وضع كل عينه في المكان المخصص لها حسب ترتيب الأرقام المدرجة في ورقة العمل.
قبل وضع العينات يتم ضبط وبرمجة جهاز COBAS®AMPLICOR® حسب الخطوات المدرجة :
1.تفريغ حاوية النفايات الخاصة بالجهاز من النفايات السائلة .
2.يحضر محلول الغسيل الخاص بالجهاز ويوضع في الحاويه الخاصه به .
3.تنظف الأسطح الداخلية للجهاز باستخدام الماء المقطر وتعقم ابرة الجهاز الخاصة بسحب العينات والكواشف باستخدام مسحات الكحول.
4.توضع حوامل الأنابيب (D-CUPS) في الأماكن المخصصة لها بالجهاز.
5.يفتح الجهاز ويفتح جهاز الكومبيوتر الملحق به ثم يتم اختيار البرنامج المشغل .
6.يتم اختيار الإختبار (HCV Qualitative Test) من قائمة اختبارات الجهاز .
7.تبرمج الكواشف الخاصة بلإختبار في الكومبيوتر وتوضع في الأماكن المناسبة لها على المنصات المخصصه في الجهاز حسب نوع الكاشف كمايلي :
8.كواشف خاصه بالفيروس الكبدي" سي" (Speceific Reagents) وهي :
أ-محلول (CX PS1) 1) HCV Probe Suspension) .
ب-محلول (CX4) (2 (HCV Probe Suspension .
9.كواشف خاصه بنواتج التكبير الخاصه بجهاز الكوبس أمبلي كور
(Generic Reagents) وهي :
أ- محلول تفكيك الحامض النووي (Denaturation Solution) (DN4)
ب-محلول المتلازم الإنزيمي (Conjugate Detection Reagent) (CN4)
ت-محلول الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي (Substrate) (SB3)
10.تبرمج الكونترولات والعينات في الكومبيوتر حسب الترتيب المدرج في ورقة العمل
11.قبل ادخال العينات بالجهاز يتم أولا غسل الجهاز باختيار عملية الغسيل المدرجة في برنامج التشغيل وذلك تفاديا لحدوث التلوث وللتأكد من استعداد الجهاز لبدء العمل .
12.توضع الحلقة ( A-RING) المحتوية على الكونترولات والعينات المضاف لها محلول السيادة (MMX) في المكان المخصص لها في قسم الدورات الحرارية بداخل الجهاز.
13.يتم غلق كابينة العمل بالغطاء المخصص ثم يتم الضغط على زر البدء في الكومبيوتر الملحق بالجهاز ايذانا لبدء العمل .
14.بعد مرور ثلاثة ساعات من بداية تشغيل الجهاز يمكن التحري عن نتائج العينات تحت الإختبار من نافذة النتائج في برنامج التشغيل وطباعتها .
15.بعد قراءة النتائج وطباعتها يجب تفريغ محتويات الجهاز من العينات والكواشف والنفايات واجراء الصيانة اللازمه له.
COBAS®AMPLICOR®HCV QUALITATIVE Test,version 2.O
يجرى هذا التحليل للتأكد من وجود الفيروس في مصل المريض حيث يتم الكشف عن وجود الحامض النووي للفيروس سي (RNA) باستخدام تقنية
( PCR) باستخدام كاشف
COBAS®AMPLICOR®HCV QUALITATIVE Test,version 2.O من شركة ROCH"", ويختبر الكاشف 96 عينة .
نوع العينات المستخدمة:
يستخدم لإجراء هذا الإختبار عينات مصل الدم وبلازما الدم.
محتويات الكاشف:
•كواشف تحضير العينات وتحتوي على:
1)محلول تحليل الخلايا( LYS) ((HCV Lysis Reagent.
2)الكونترول الداخلي للعينات (IC)HCV Internal Control) ).
3)مخفف الحمض النووي الفيروسي((HCV-DIL ((HCV-RNA Diluent .
•كواشف الكونترولات وتحتوي على:
1)كونترول ايجابي وكونترول سلبي للفيروس الكبدي سيHCV Controls) (CTL)).
2)محلول سلبي لبلازما الدم ( NHP) (Negative Human Plasma).
•كواشف التكبير وتحتوي على:
1)مخلوط السيادة لإختبارالحمض النووي الفيروسي(HCV-Master Mix)( MMX) .
2)أيونات المنجنيز (Mn+2) المحفزة لتفاعل (PCR) .
•كواشف الكشف عن نواتج التكبيرللفيروس وتحتوي على :
1)محلول (CX PS1) 1) (HCV Probe Suspension .
2)محلول (CX4) 2) HCV Probe Suspension) .
•كواشف الكشف عن نواتج التكبيرالخاصة بجهاز
COBAS®AMPLICOR® وتحتوي على:
1)محلول تفكيك الحامض النووي (Denaturation Solution) (DN4).
2)محلول المتلازم الإنزيمي Congugate Detection Reagent) (CN4) ).
3)محلول الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي(Substrate) (SB3) .
4)محلول الغسيل الخاص بجهاز COBAS®AMPLICOR®:
(WB)Washing Buffer) ).
اللوازم والمواد المستخدمة في الإختبار والغير متوفرة في الكاشف:
1)كحول الإيثانول بتركيز 70%.
2)كحول الإيزوبروبانول بتركيز 100%.
3)ورقة عمل (Work Sheet) المخصصه لاختبار (.(HCV qualitative
الأدوات الملحقة بالجهاز واللازمة لإجراءالإختبار:
1)حلقات الأنابيب (A-RING) وتحتوي على 12 أنبوبة متراصة بشكل دائري سعة الواحدة منها 100µ لزوم تكبير الحامض النووي.
2)حوامل أنابيب (D-CUPS) تحتوي على عدد 70 انبوبة سعة 2 مل متراصه في خمسة صفوف متوازيه في كل صف 14 أنبوبة لزوم الكشف عن الحامض النووي المكبر.
3)حوامل الكواشف ( Reagent Cassette) وهي خاصة لوضع المحاليل داخل الجهاز.
التحضيرات :
•تحضير مخلوط السيادة لإختبار الحمض النووي الفيروسي
Master Mix) Working)
1.يضاف 100µ من HCV (Mn+2) الى عبوة HCV ( MMX) ثم يرج الخليط جيدا بواسطة الهزاز(Vortex) ويحفظ عند درجة حرارة من(2˚- 8˚م) لإستخدامة خلال 4 ساعات فقط من التحضير.
2.يضاف 50µ من (Working M.mix) الى أنابيب (A-RING) وتحفظ عند درجة حرارة (2˚- 8˚م) قبل ادخالها في الجهاز لإتمام عملية تكبير الحامض النووي الفيروسي Amplification) ).
•تحضير محلول تحليل الخلايا Working Lysis Reagent))
يضاف 100µ من HCV(IC) الى عبوة من ( HCV( LYS ثم يرج الخليط جيدا بواسطة الهزاز ويحفظ عند درجة حرارة الغرفة من (20˚ - 25˚م) لإستخدامة خلال 8 ساعات فقط من التحضير.
•تحضير محلول الغسيل الخاص بالجهاز (WB)Washing Buffer))
يضاف500 مل من محلول الغسيل المركز (WB) الى 4500 مل من الماء المقطر المتأين (Deionised Distal Water) ثم يوضع المحلول المحضرفي الحاوية المخصصة له والملحقه بالجهاز .
خطوات اجراء الإختبار:
1.تسجيل الكونترولات, كونترول سلبي ثم كونترول ايجابي ثم العينات الأولى فالثانية حسب الترتيب على ورقة العمل الخاصه بلإختبار.
2.ترقم أنابيب الإختبار سعة 1,5 مل بعدد العينات المراد فحصها مع اضافة أنبوبة للكونترول الإيجابي وأنبوبة للكونترول السلبي.
3.يضاف 400µ من مخلوط السيادة لإختبار الحمض النووي الفيروسي.
(Working Lysis Solution) المحضر الى الأنابيب المرقمة ابتداء بالكونترول السلبي ثم الكونترول الإيجابي ثم العينة الأولى فالثانية ......الخ مع مراعاة تعليم الأنابيب.
4.تضاف 200µ من كل عينة الى الأنبوبة المرقمة برقم العينة ابتداء بالعينة الأولى وانتهاء بالعينة الأخيرة مع عمل مزج خفيف بواسطة الماصة.
5.يضاف 200µ من المحلول المعادل لبلازما الدم NHP)) لأنابيب الكونترولات فقط.
6.يضاف 20µ من الكونترولات السالبة والموجبة في الأنابيب المخصصة لها.
7.تحضن جميع الأنابيب عند درجة حرارة 60˚م في سخان جاف لمدة عشرة دقائق.
8.يضاف 600µ من كحول الإيزوبروبانول 100% لجميع العينات والكونترولات ثم ترج بواسطة الهزاز(Vortex) لمدة 10 ثواني.
9.توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي على سرعة 12500rpm ولمدة 15 دقيقة مع مراعاة أن تكون جهة الأنابيب المعلمه للخارج.
10.تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى الحامل المخصص ثم يتم التخلص من الكحول بحرص شديد بعيدا عن الجهة المعلمة باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
11.يضاف 1000µ من كحول الإيثانول 70% لجميع العينات والكونترولات ثم ترج الأنابيب جيداً باليد.
12.توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي على سرعة 12500rpm لمدة 5 دقائق مع مراعاة أن تكون جهة الأنابيب المعلمه للخارج.
13.تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى الحامل المخصص ثم يتم التخلص من الكحول بحرص شديد بعيدا عن الجهة المعلمة باستخدام الماصات البلاستيكية المعقمة ذات الإستخدام الواحد.
14.يضاف 200µ من مخفف الحمض النووي الفيروسي HCV(DIL) على الراسب المتجمع في أسفل الأنبوب (Pellet) ثم يتم مزج وخلط المحلول قدرالمستطاع لتكسير(Pellet) والحصول على معلق متجانس من الحمض النووي.
15.يؤخذ 50µ من معلق الحمض النووي لكل عينة بعد مزجه جيدا ويضاف الى (Working M.mix) المحضر الموجود في الأنابيب المخصصة للعينات في الحلقة A-RING)) مع مراعاة وضع كل عينه في المكان المخصص لها حسب ترتيب الأرقام المدرجة في ورقة العمل.
قبل وضع العينات يتم ضبط وبرمجة جهاز COBAS®AMPLICOR® حسب الخطوات المدرجة :
1.تفريغ حاوية النفايات الخاصة بالجهاز من النفايات السائلة .
2.يحضر محلول الغسيل الخاص بالجهاز ويوضع في الحاويه الخاصه به .
3.تنظف الأسطح الداخلية للجهاز باستخدام الماء المقطر وتعقم ابرة الجهاز الخاصة بسحب العينات والكواشف باستخدام مسحات الكحول.
4.توضع حوامل الأنابيب (D-CUPS) في الأماكن المخصصة لها بالجهاز.
5.يفتح الجهاز ويفتح جهاز الكومبيوتر الملحق به ثم يتم اختيار البرنامج المشغل .
6.يتم اختيار الإختبار (HCV Qualitative Test) من قائمة اختبارات الجهاز .
7.تبرمج الكواشف الخاصة بلإختبار في الكومبيوتر وتوضع في الأماكن المناسبة لها على المنصات المخصصه في الجهاز حسب نوع الكاشف كمايلي :
8.كواشف خاصه بالفيروس الكبدي" سي" (Speceific Reagents) وهي :
أ-محلول (CX PS1) 1) HCV Probe Suspension) .
ب-محلول (CX4) (2 (HCV Probe Suspension .
9.كواشف خاصه بنواتج التكبير الخاصه بجهاز الكوبس أمبلي كور
(Generic Reagents) وهي :
أ- محلول تفكيك الحامض النووي (Denaturation Solution) (DN4)
ب-محلول المتلازم الإنزيمي (Conjugate Detection Reagent) (CN4)
ت-محلول الكاشف اللوني للمتلازم الإنزيمي (Substrate) (SB3)
10.تبرمج الكونترولات والعينات في الكومبيوتر حسب الترتيب المدرج في ورقة العمل
11.قبل ادخال العينات بالجهاز يتم أولا غسل الجهاز باختيار عملية الغسيل المدرجة في برنامج التشغيل وذلك تفاديا لحدوث التلوث وللتأكد من استعداد الجهاز لبدء العمل .
12.توضع الحلقة ( A-RING) المحتوية على الكونترولات والعينات المضاف لها محلول السيادة (MMX) في المكان المخصص لها في قسم الدورات الحرارية بداخل الجهاز.
13.يتم غلق كابينة العمل بالغطاء المخصص ثم يتم الضغط على زر البدء في الكومبيوتر الملحق بالجهاز ايذانا لبدء العمل .
14.بعد مرور ثلاثة ساعات من بداية تشغيل الجهاز يمكن التحري عن نتائج العينات تحت الإختبار من نافذة النتائج في برنامج التشغيل وطباعتها .
15.بعد قراءة النتائج وطباعتها يجب تفريغ محتويات الجهاز من العينات والكواشف والنفايات واجراء الصيانة اللازمه له.