النتائج 1 إلى 7 من 7

الموضوع: •تقنية استخلاص الـدنا DNA من الخلايا المناعية Buffy coat باستخدام كاشفQIAGEN

  1. #1
    تاريخ التسجيل
    Feb 2008
    الدولة
    بريطانيا
    المشاركات
    47

    •تقنية استخلاص الـدنا DNA من الخلايا المناعية Buffy coat باستخدام كاشفQIAGEN


    •تقنية استخلاص الـدنا DNA من الخلايا المناعية Buffy coat

    يتم بهذه التفنية استخلاص الحامض النووي الدنا (DNA) من الخلايا المناعية باستخدام كاشف QIAamp® DNA Mini andBlood Mini
    هذا الكاشف يستخلص الحمض النووي DNA من 50 عينة فقط وهو من شركة QIAGEN®

    محتويات الكاشف:

    1.يحتوي الكاشف على 50 أنبوبة سعة 2 مل .
    2.عبوة محلول AL* ( Buffer AL*) .
    3.عبوة محلول AW1* المركزة ( Buffer AW1* Concentrate) .
    4.عبوة محلول AW2 المركزة (Buffer AW2 Concentrate ) .
    5.عبوة محلول AE 2 ( Buffer AE 2) .
    6.عبوة إنزيم البروتييز ( QIAGEN Protease 1 vial).
    7.عبوة 1,2 مل محلول مذيب إنزيم البروتييز ( Protease Solvant).
    8.يحتوي الكاشف على رؤوس الأنابيب المفلتره ( QIAamp Maxi Spin Columns).
    ملاحظات قبل اجراء الاختبار:

    1-جميع خطوات العمل يجب أن تتم في درجة حرارة الغرفة (20ºم - 25ºم )
    2-يسخن السطح الساخن ( Heat Block) الى درجة حرارة 56˚م وترقم الأنابيب سعة 2 مل بعدد العينات.
    3-يتم اخراج العينات من الفريزروتترك حتى تأخذ درجة حرارة الغرفة
    (20ºم - 25ºم ), بعد ذلك يتم البدء بالتحضيرات .

    التحضيرات :

    1-يذاب انزيم البروتينيز الجاف في المحلول المذيب المرفق معه وبعد اذابتة يقسم الى عدة أقسام في عبوات معقمة يحتوي كل منهاعلى 400µ من الإنزيم , وتحفظ العبوات غير المستخدمة في درجة حرارة (-20˚م) ويسجل على كل عبوة اسم الإنزيم وتاريخ التحضير.
    2-تحضير محلول (AW1) وذلك باضافة 25 مل من كحول الايثانول 100% الى العبوة.
    3-تحضير محلول (AW2) وذلك باضافة 30 مل من كحول الايثانول 100% الى العبوة.
    خطوات اجراء الإختبار:
    1-ترقم أنابيب جهاز الطرد المركزي الصغيرة سعة 1,5 مل بعدد العينات المراد استخلاص الحمض النووي ( (DNA منها.
    2-يوضع 20µ من انزيم البروتينيزالمحضر في قاع جميع الأنابيب المرقمة.
    3-يضاف 200µ من كل عينة من عينات الخلايا البيضاء المحفوظه في المحلول الملحي PBS) ) الى الأنابيب المرقمة مع مراعاة وضع كل عينة في الأنبوبة التي تحمل نفس الرقم .
    4-يضاف 200µ من محلول AL)) لجميع العينات ( ثم تغلق الأنابيب جيدا منعا للتلوث) وتخلط بواسطة جهاز الرج ( Vortex) لمدة 15 ثانية .
    5-تحضن الأنابيب في السطح الساخن عند درجة حرارة 56˚م لمدة 10 دقائق .
    6-توضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي لمدة 5 ثواني لازالة القطرات من الغطاء .
    7-يضاف 200µ من كحول الايثانول 100% للعينات ويخلط جيدا بواسطة
    جهاز الرج ( Vortex) ثم تغلق الأنابيب وتوضع في جهاز الطرد المركزي لمدة 15 ثانية .
    8-تجهز الفلاتر بتركيبها على أنابيب 2مل وترقم بأرقام العينات .
    9-بحرص بالغ يوضع ناتج كل أنبوبة في الخطوة 6 على الفلتر المركب على أنابيب 2مل مع مراعاة عدم تلوث عنق فلترالأنبوبة ثم تغلق الفلاتر وتوضع جميع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي على سرعة 8000rpm لمدة دقيقة واحدة بعد ذلك يتم التخلص من الأنابيب الخارجية القديمه المحتوية على السائل المفلتر وتستبدل بأنابيب خارجية جديدة .
    10-بحرص شديد يضاف 500µ من محلول(AW1) مع مراعاة عدم تلوث عنق فلترالأنبوبة وتغلق فلاترالأنابيب وتوضع في جهاز الطرد المركزي على سرعة 8000rpm لمدة دقيقة واحدة , تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى حامل الأنابيب ويستبدل الأنبوب السفلي بآخر جديد .
    11-بحرص بالغ يفتح غطاء الفلتر ويضاف 500µ من محلول (AW2) مع مراعاة عدم تلوث عنق فلترالأنبوبة ثم تغلق فلاترالأنابيب وتوضع في جهاز الطرد المركزي على أعلى سرعة 14000rpm لمدة 3 دقائق ولمزيد من النقاء يمكن تغيير الأنبوبة ووضع الأنبوبة في جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحده فقط ثم يتم التخلص من الأنابيب الخارجيه المحتويه على السائل المفلتر.
    12-يوضع الفلتر في أنابيب جديدة سعة 2 مل ويضاف200µ من محلول AE) ) أو من الماء المقطر وتغلق فلاترالأنابيب وتحفظ في درجة حرارة الغرفة لمدة دقبقة واحدة بعد ذلك توضع في جهاز الطرد المركزي عند سرعة 8000 rpm لمدة دقيقة واحدة بعد ذلك تنقل الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الى حامل الأنابيب ويحفظ الـدنا (DNA ) الموجود بها عند (-20˚م ) لحين الإستخدام.
    •الكشف عن وجود الحامض النووي النقي (Pure DNA) أوالحامض النــــــووي المكبـــــــــر (Amplicon DNA) بواسطة ترحيلة في هلامة الأجار بإستخدام طقم الفصل الكهربي (Agrose Gel Electrophoreses)
    يتم الكشف عن وجود الحامض النووي النقي وكذلك الحامض النووي المكبر بواسطة تمريره في هلامة الأجار المغمورة في جهاز الفصل الكهربي (Agrose Gel Electrophoreses).

    العينة المستخدمة :
    1.عينة الحمض النووي النقي(Pure DNA) المستخلص من الخلايا المناعية لجميع أفراد مجموعة العمل.
    2.عينة الحامض النووي المكبر(DNA Amplicon) باستخدام تقنية ((PCR.

    الأدوات اللازمة لإجراء الاختبار:
    1.طقم الفصل الكهربي (Agrose Gel Electrophoreses)
    ويتكون من:
    •طبق بلاستيكي للأجار.
    •أمشاط تثبت على الطبق لزوم تشكيل نقر على هلامة الأجار.
    •الحاوية المتنقلة الداخلية لجهازالفصل وهي متصلة بالدائرة الكهربائية.
    2.أنابيب اختبار سعة 2مل بعدد العينات.
    3.محلول TAE)) (Tries Acetate EDTA)
    4.جهاز الأشعة الفوق بنفسجية.
    5.دورق زجاجي.
    6.لهب بنزين.
    7.شريط لاصق.
    8.مقدار من صبغة بروميد الفينيل الزرقاء (Bromo phiynile blue) (مذوبه في كمية متساويه من الجلسرين والماء).
    التحــضيــر :
    1)يتم اذابة العينات من الفريزر(Pure DNA) أو (DNA Amplicon) وتترك في درجة حرارة الغرفة من (20°م-25°م).
    2)يضاف مقدار من مسحوق الأجار الى محلول (TAE Buffer) المذاب في الماء المقطر بنسبة تركيز 2% ويذوب الخليط جيدا" بداخل دورق زجاجي , يوضع الدورق على اللهب مع التحريك المستمر حتى يتم ذوبان الأجار تماما" وحتى يتجانس المخلوط.
    3)يترك محلول الأجار لبعض الوقت حتى تنخفض درجة حرارته قليلا".
    4)يضاف إلى الدورق مقدار من صبغة الاثيديوم بروميد(Ethidum Bromide)
    مع توخي الحرص عند استخدامها فهي مادة مشعة مسرطنة وسامة , يقلب الدورق حتى تتجانس الصبغة مع الأجار.
    5)يجهز طبق الأجار بغلق حوافه الأربعة بالشريط اللاصق العريض حتى يصبح الشريط كالجدار العازل المانع لتسرب الأجار من الطبق قبل أن يجمد.
    6)يصب محلول الأجار المحضر في الطبق المجهز ثم تثبت الأمشاط على مسافات متساوية في أماكنها المخصصة لها و يترك الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة من (20°م-25°م) حتى تجمد هلامة الأجار.
    7)ترقم أنابيب سعة 2 مل بأرقام العينات المختبرة ثم يوضع
    من كل عينة10µ في الأنبوبة المخصصة برقمها.
    8)يوضع على كل أنبوبة5µ من صبغة بروميد الفينيل الزرقاء (Bromo phiynile blue) الى نهاية العينات.
    9)تزال الأمشاط والشريط اللاصق من الطبق .
    10)يوضع من كل عينة (Pure DNA),(Amplicon DNA) مقدا5µ في النقرة المخصصة له في هلامة الأجار.
    11)يوضع الطبق في حاوية جهاز الفصل الكهربي ويغمر بمحلول الغمر TAE)).
    12)تفتح دائرة الفصل الكهربائية لكي يمر التيار خلال هلامة الأجار فيعمل على ترحيل الحامض النووي النقي أو المكبر من القطب الموجب إلى القطب السالب .
    13)يترك الطبق حوالي 60دقيقة وبعد مرور الوقت تظهر خطوط بنفسجية اللون تشير إلى وجود الحامض النووي (Pure DNA), (Amplicon DNA) ويمكن الكشف عن هذه الخطوط بواسطة الأشعة الفوق بنفسجية (UV.System) .

  2. #2
    تاريخ التسجيل
    Dec 2008
    الدولة
    الولايات المتحده الامريكيه
    المشاركات
    85
    الاخت القديره : أميره الورود شكراً لموضوعك
    وأرى ان فيه بعض الآخطاء ربما لم تركزي عليها

    أولا حول اظافت ألآ PROTEINASE الانزيم دائماً يضاف أخيراً

    ثانياً VORTEX PROCESS في المرحله الثانيه اظن انها ستعمل DNA SHEARIN

    ثالثاً لم تذكري انكم أضفتم RNASE
    اذأً لم تستخلصوا الحامض الدنووي DNA ولكن خليط DNA + RNA

    رابعاُ IN GEL ELECTOPHORSIS
    ال DNA تسافر من القطب السالب بأتجاه القطب الموجب حبث شحنته سالبه ولوكان كما دكرتي ستركطالGEL

    خامساً لم تذكري نوع الGEL هل AGAROSE OR POLYACRYLAMID

    سادساً لم تذكري الغرض من استخدام كل المحاليل

    سابعاً: اذا اخذتم صوره للجيل ارجوا منك ادراجها في الموضوع حتى يتسنى لنا قرائ ال GEL IMAGE

    واخيراً لك مني جزيل الشكر اختي وارجوا ان لا تزعجكي مداخلتي ولك مني كل الشكر

  3. #3
    تاريخ التسجيل
    Oct 2008
    الدولة
    اليمن
    المشاركات
    274
    شكرا على الموضوع مع تمنياتي لكي بالنجاح دوما

  4. #4
    تاريخ التسجيل
    Feb 2008
    الدولة
    بريطانيا
    المشاركات
    47

    أستاذ جبر البعداني


    شكراً على التعليق
    أولاً بالنسبة لإضافة PROTEINASE لا يغير النتيجة سواء أضيف في البداية أو في النهايه بالتجربه
    ثانياً بالنسبة للــDNA لايحدث له DNA SHEARIN لأنه ثابت ومتماسك وقوي.
    ثالثاً باستخدام هذا الكاشف تم استخلاص DNA من الخلايا المناعيه وكما تفضلت أنا لم أضع RNASE لأكسر RNA وحصلت على خليط ولكن بالتمرير في الأجروز سيظهر الـ DNA فقط لأنه أكبر في الوزن الجزيئي من الـ RNA
    رابعاً وخامساً وسادساً – أعتذر على الغلطه الغير مقصوده-نعم الرحيل من القطب السالب للموجب- الجل أجاروز – المحاليل للتنقية الـ DNAمن الشوائب
    سابعاً لدي صور جميله جداً جداً وأنا لا أعرف كيفية اضافة الصور في المنتدى – – مع اعتذاري لجميع القراء عن الأخطاء الاملائيه التي تظهر وخاصة عند كتابة درجات الحرارة-
    شكري لكل من تفضل بقراءة المواضيع وأسأل الله أن ينفع المسلمين بها
    التعديل الأخير تم بواسطة Idealism ; 18-12-2008 الساعة 04:18 PM سبب آخر: حسب قوانين المنتدى _ يمنع كتابة عنوان الأيميل

  5. #5
    تاريخ التسجيل
    Dec 2008
    الدولة
    الولايات المتحده الامريكيه
    المشاركات
    85
    اقتباس المشاركة الأصلية كتبت بواسطة أميرة الورد مشاهدة المشاركة

    شكراً على التعليق
    أولاً بالنسبة لإضافة PROTEINASE لا يغير النتيجة سواء أضيف في البداية أو في النهايه بالتجربه
    ثانياً بالنسبة للــDNA لايحدث له DNA SHEARIN لأنه ثابت ومتماسك وقوي.
    ثالثاً باستخدام هذا الكاشف تم استخلاص DNA من الخلايا المناعيه وكما تفضلت أنا لم أضع RNASE لأكسر RNA وحصلت على خليط ولكن بالتمرير في الأجروز سيظهر الـ DNA فقط لأنه أكبر في الوزن الجزيئي من الـ RNA
    رابعاً وخامساً وسادساً – أعتذر على الغلطه الغير مقصوده-نعم الرحيل من القطب السالب للموجب- الجل أجاروز – المحاليل للتنقية الـ DNAمن الشوائب
    سابعاً لدي صور جميله جداً جداً وأنا لا أعرف كيفية اضافة الصور في المنتدى – مع اعتذاري لجميع القراء عن الأخطاء الاملائيه التي تظهر وخاصة عند كتابة درجات الحرارة-
    شكري لكل من تفضل بقراءة المواضيع وأسأل الله أن ينفع المسلمين بها

    انا اسف جداً اظن تعقيبي قد ازعجك ونحن هنا فقط للمناقشه يكمل مننا الاخر
    واذا قصرت فانتِ تكمليني والعكس

    لكن ان من اساليب التعامل مع الانزيمات ان تضاف موخراً لان الانزيمات حساسه جداً وخصوصاً للحراره والPH

    ثانياً اختي الكريمه الDNA ليس متماسك في حاله استخلاصه وانتِ تعرفين بانه جزي كبير واذا حدث له فورتكس فانه سهل الكسر ودانماً الجزيئات الطويله تكون سهله الكسر ولاتنسي اختي الغاليه ان الهيستونات والبروتينات الاخري هي ما تزيد من تماسه ولكن من بعد تحطيمها فانه سهل الكسر وتUرفي عند معاملته بالايثانول كبف بحركه جينتلي لاجل لان نحطمه وعنه لفه بالساق الزجاجيه ايضاً

    بالنسبه لل RNA اذا لم يظه على الجل فلم فلا يعني انه ليس في الماده النوويه التي قمتم باستخلاثها وصوره اجيل سوف تعصي نتائج خاظئه مائه بالمائه

    ولكن ربما احد الLحاليل الذكوره يحتويه
    وبالنسه للRNA ليس بصفير جداً حتى يمر من الجل الى المجلول البفر TE

    اما بالنسبه للمحاليل لكل محلول عمله الخاص أبتداء من ال PROTEINASE الى انتهاء ب TE BUFFER في اا GEL ELECTROPHORSIS
    التعديل الأخير تم بواسطة Idealism ; 18-12-2008 الساعة 04:19 PM

  6. #6
    تاريخ التسجيل
    Apr 2008
    الدولة
    سوريا
    المشاركات
    25
    شكرا ياأمورة على الموضوع القيم

  7. #7
    تاريخ التسجيل
    Nov 2008
    الدولة
    saudi arabia
    المشاركات
    12
    السلام عليكم مووضوع وحلوو وفى اضافه عندى انDNA سالب يعنى Negative لان فيه مجموعه من الفوسفاااات Becuose of group phosphates

معلومات الموضوع

الأعضاء الذين يشاهدون هذا الموضوع

الذين يشاهدون الموضوع الآن: 1 (0 من الأعضاء و 1 زائر)

ضوابط المشاركة

  • لا تستطيع إضافة مواضيع جديدة
  • لا تستطيع الرد على المواضيع
  • لا تستطيع إرفاق ملفات
  • لا تستطيع تعديل مشاركاتك
  •  
vBulletin skin developed by VillaARTS.