تويت
طريقة تقدير كمية أنزيم الفوسفاتيز القاعدى
- المبدأ العام :
تقدم أنزيمات الفوسفاتيز بتسريع تميؤ استرات الفوسفات . ومن الناحية الطبية هناك نوعان من أنزيمات الفوسفاتيز ، وكلاهما يقومان بالدور نفسة ، ولكنهما يختافان عن بعضهما البعض بدرجة الرقم الهيدروجينى ( PH ) للوسط التى يظهر نشاط كل منهما .
هناك عدة طرق لقياس نشاط أنزيم الفوسفاتيز القاعدى ( الذى يظهر نشاطة بالشكل الأمثل عند PH = 9.80 ) وستستخدم طريقة بريزى
ولورى وبروك ( Breaaey - Lowry - and Brock ) المعتمدة من قبل الاتحاد العالمى للكيمياء الطبية وهى تتلخص فى عملية
تميؤ مادة التفاعل بارا - نيتروفينيل فوسفات أنزيميا إلى بارا - نيتروفينولوفوسفات فى وجود مستقبل لمجموعات الفوسفات هو ثنائى
ايثانول الأمين الذى يلعب دورا منظما . ويقاس لون بارافينول الأصفر الذهبى فى الوسط القاعدى . وعدل التغير فى شدة امتصاص هذا المركب تتناسب طرديا مع كمية نشاط أنزيم الفوسفاتيز القاعدى فى العينة المستخدمة .
- الأجهزة والأدوات والمواد المستعملة :
جهاز مطياف ضوئى - أنابيب اختبار - ماصات آلية - حاضنة أو فرن - ساعة إيقاف - مجموعة الكواشف والمواد والمحاليل الخاصة بالتجربة المتوفرة ( تختلف هذة الكواشف فى طريقة تحضيرها وفى المواد الحافظة المضافة إليها بين منتج وآخر ) وبالنسبة لهذة
التجربة فهى تحتوى : كاشف المحلول المنظم ومادة التفاعل - مصلا حديثا أو بلازما المحضرة بإستخدام الهيبارين فقط .
- خطوات العمل :ا - تحضير الكواشف المستعملة : تقرأ نشرة التعليمات المرافقة فى صندوق العبوات والتى تحتوى على الأنزيم - مادة الهدف التى
تحتوى باراانيتروفينيا فوسفات إما على هيئة أقراص ( حيث يستعمل قرص لكل تجربة ) أو على هيئة وزن معلوم من مسحوق متجمد
داخل عبوة ( تكون صلاحيتها حسب النوع والمنتج ) . وعادة ما تذاب العبوة أو القرص فى جحم معلوم من المحلول المنظم ، وذلك
طبقا للتعليمات الموجودة .
بالإيضافة لمادة الهدف يوجد أيضا فى صندوق الكواشف ، كاشف المحلول المنظم ( عند رقم هيدروجينى 9.8 =PH ) الذى يحتوى
المادة التنشيطية التنظيمية الكحول الأمينى ثنائى ايثانول أمين وكلوريد الماغنيسيوم وأزيد الصوديوم الذى يستخدم كمادة حافظة .
هذا ويبقى الكاشف العملى المحضر لمدة شهر إذا حفظ فىالثلاجة عند درجة حرارة تتراوح بين 2 - 8 درجة مئوية ولمدة اسبوع
واحد فقط إذا ترك فى درجة حرارة الغرفة .
ب - خطوات التجربة :
1 - يسخن الكاشف العملى المحضر والعينة وأنابيب الاختبار وأنبوبة الجهاز ( Cuvete ) عند درجة 30 درجة مئوية لمدة عشرة دقائق
ويجب المحافظة على هذة الدرجة طيلة زمن التجربة مع حدودخطأ لا يتجاوز 0.5 درجة مئوية .
2 - ينقل بالماصة ( 2.5 مليلتر ) من الكاشف العملى إلى أنبوب اختبار جافة ونظيفة .
3 - ينقل بالماصة ( 50 ميكرولتر ) من العينة ( المصل أو البلازما ) إلى أنبوب الاختبار ثم يرج المزيج حتى يتجانس .
4 - يجهز المطياف عند طول موجى مقدارة 405 نانو متر ، ويكون المسار الضوئى ( 1 سم ) .
5 - يضبط الجهاز عند الصفر ضد الهواء ( لايوجد محلول قياسى ) .
6 - تقاس شدة الامتصاص للمحلول بعد مرور دقيقة واحدة .
7 - تشغل ساعة الإيقاف وتقاس شدة الامتصاص على فترات زمنية بين كل منهما دقيقة أى 3،2،1 .
- حسابات النتائج :
يتم تسجيل شدة الامتصاص ، وتحسب معدلات التغير فى شدة الامتصاص ، وتوضح فى جدول : الزمن - شدة الامتصاص A - معدل
التغير فى شدة الامتصاص .
ثم تجرى الحسابات :
- تحسب معدلات التغير فى شدةالامتصاص وذلك بطرح كل قراءة من التى تليها ، وتسجل هذة القيم فى الجدول المذكور فى العمود الثالث .
- يتم حساب المتوسط الحسابى لمعدل التغير فى شدة الامتصاص وذلك حسب المعادلة :
المتوسط الحسابى لمعدل التغير (A ) = مجموع التغير فى شدة الامتصاص ،على عدد القراءات ( عملية قسمة ) .- يتم تطبيق المعادلة التالية لحساب درجة نشاط الانزيم :
درجة نشاط الأنزيم = X Aالحجم الكلى للتفاعل على 6.3 x Mm x حجم العينة المستخدمة = .......... / مليلتر .حيث : 6.3 هو معامل الامتصاص الميليمو لارى للمرافق الأنزيمى عند الطول الموجى 340 نانو متر ودرجة حرارة الغرفة 30 درجة مئوية .
ولتحويل هذة الوحدات الناتجة إلى وحدة أنزيمية / لتر تضرب النتيجة فى 1000 ، حيث يكون هنا لمركب نيتروفينول عند 405 فينول
ودرجة حرارة 30 درجة مئوية ويساوى 18.75 .
- ملاحظات عامة :
1- يجب أن تكون عينة المصل لتقدير فعالية الأنزيم حديثة . أما إذا حفظت فى الثلاجة ( 2-08 م ) فإن الأنزيم يفقد 10% من فعاليتة
خلال ثلاثة أيام .
2 - يختلف معامل المتصاص باختلاف درجات الحرارة ، فهو يضرب بالمعامل 0.76 عند درجة 25 درجة مئوية وبالمعامل 1.98
عند درجة 37 درجة مئوية .
3 - إذا كان معدل التغير فى شدة الامتصاص لا يزيد على 0.250 أو كانت درجة نشاط الأ نزيم أعلى من 700 وحدة دولية / لتر عند
30 درجة مئوية فإنة يجب إعادة التجربة مع تخفيف العينة بمحلول فيسيولوجى ( كلوريد الصوديوم 0.9% ) بمقدار خمس مرات .
تقدم أنزيمات الفوسفاتيز بتسريع تميؤ استرات الفوسفات . ومن الناحية الطبية هناك نوعان من أنزيمات الفوسفاتيز ، وكلاهما يقومان بالدور نفسة ، ولكنهما يختافان عن بعضهما البعض بدرجة الرقم الهيدروجينى ( PH ) للوسط التى يظهر نشاط كل منهما .
هناك عدة طرق لقياس نشاط أنزيم الفوسفاتيز القاعدى ( الذى يظهر نشاطة بالشكل الأمثل عند PH = 9.80 ) وستستخدم طريقة بريزى
ولورى وبروك ( Breaaey - Lowry - and Brock ) المعتمدة من قبل الاتحاد العالمى للكيمياء الطبية وهى تتلخص فى عملية
تميؤ مادة التفاعل بارا - نيتروفينيل فوسفات أنزيميا إلى بارا - نيتروفينولوفوسفات فى وجود مستقبل لمجموعات الفوسفات هو ثنائى
ايثانول الأمين الذى يلعب دورا منظما . ويقاس لون بارافينول الأصفر الذهبى فى الوسط القاعدى . وعدل التغير فى شدة امتصاص هذا المركب تتناسب طرديا مع كمية نشاط أنزيم الفوسفاتيز القاعدى فى العينة المستخدمة .
- الأجهزة والأدوات والمواد المستعملة :
جهاز مطياف ضوئى - أنابيب اختبار - ماصات آلية - حاضنة أو فرن - ساعة إيقاف - مجموعة الكواشف والمواد والمحاليل الخاصة بالتجربة المتوفرة ( تختلف هذة الكواشف فى طريقة تحضيرها وفى المواد الحافظة المضافة إليها بين منتج وآخر ) وبالنسبة لهذة
التجربة فهى تحتوى : كاشف المحلول المنظم ومادة التفاعل - مصلا حديثا أو بلازما المحضرة بإستخدام الهيبارين فقط .
- خطوات العمل :ا - تحضير الكواشف المستعملة : تقرأ نشرة التعليمات المرافقة فى صندوق العبوات والتى تحتوى على الأنزيم - مادة الهدف التى
تحتوى باراانيتروفينيا فوسفات إما على هيئة أقراص ( حيث يستعمل قرص لكل تجربة ) أو على هيئة وزن معلوم من مسحوق متجمد
داخل عبوة ( تكون صلاحيتها حسب النوع والمنتج ) . وعادة ما تذاب العبوة أو القرص فى جحم معلوم من المحلول المنظم ، وذلك
طبقا للتعليمات الموجودة .
بالإيضافة لمادة الهدف يوجد أيضا فى صندوق الكواشف ، كاشف المحلول المنظم ( عند رقم هيدروجينى 9.8 =PH ) الذى يحتوى
المادة التنشيطية التنظيمية الكحول الأمينى ثنائى ايثانول أمين وكلوريد الماغنيسيوم وأزيد الصوديوم الذى يستخدم كمادة حافظة .
هذا ويبقى الكاشف العملى المحضر لمدة شهر إذا حفظ فىالثلاجة عند درجة حرارة تتراوح بين 2 - 8 درجة مئوية ولمدة اسبوع
واحد فقط إذا ترك فى درجة حرارة الغرفة .
ب - خطوات التجربة :
1 - يسخن الكاشف العملى المحضر والعينة وأنابيب الاختبار وأنبوبة الجهاز ( Cuvete ) عند درجة 30 درجة مئوية لمدة عشرة دقائق
ويجب المحافظة على هذة الدرجة طيلة زمن التجربة مع حدودخطأ لا يتجاوز 0.5 درجة مئوية .
2 - ينقل بالماصة ( 2.5 مليلتر ) من الكاشف العملى إلى أنبوب اختبار جافة ونظيفة .
3 - ينقل بالماصة ( 50 ميكرولتر ) من العينة ( المصل أو البلازما ) إلى أنبوب الاختبار ثم يرج المزيج حتى يتجانس .
4 - يجهز المطياف عند طول موجى مقدارة 405 نانو متر ، ويكون المسار الضوئى ( 1 سم ) .
5 - يضبط الجهاز عند الصفر ضد الهواء ( لايوجد محلول قياسى ) .
6 - تقاس شدة الامتصاص للمحلول بعد مرور دقيقة واحدة .
7 - تشغل ساعة الإيقاف وتقاس شدة الامتصاص على فترات زمنية بين كل منهما دقيقة أى 3،2،1 .
- حسابات النتائج :
يتم تسجيل شدة الامتصاص ، وتحسب معدلات التغير فى شدة الامتصاص ، وتوضح فى جدول : الزمن - شدة الامتصاص A - معدل
التغير فى شدة الامتصاص .
ثم تجرى الحسابات :
- تحسب معدلات التغير فى شدةالامتصاص وذلك بطرح كل قراءة من التى تليها ، وتسجل هذة القيم فى الجدول المذكور فى العمود الثالث .
- يتم حساب المتوسط الحسابى لمعدل التغير فى شدة الامتصاص وذلك حسب المعادلة :
المتوسط الحسابى لمعدل التغير (A ) = مجموع التغير فى شدة الامتصاص ،على عدد القراءات ( عملية قسمة ) .- يتم تطبيق المعادلة التالية لحساب درجة نشاط الانزيم :
درجة نشاط الأنزيم = X Aالحجم الكلى للتفاعل على 6.3 x Mm x حجم العينة المستخدمة = .......... / مليلتر .حيث : 6.3 هو معامل الامتصاص الميليمو لارى للمرافق الأنزيمى عند الطول الموجى 340 نانو متر ودرجة حرارة الغرفة 30 درجة مئوية .
ولتحويل هذة الوحدات الناتجة إلى وحدة أنزيمية / لتر تضرب النتيجة فى 1000 ، حيث يكون هنا لمركب نيتروفينول عند 405 فينول
ودرجة حرارة 30 درجة مئوية ويساوى 18.75 .
- ملاحظات عامة :
1- يجب أن تكون عينة المصل لتقدير فعالية الأنزيم حديثة . أما إذا حفظت فى الثلاجة ( 2-08 م ) فإن الأنزيم يفقد 10% من فعاليتة
خلال ثلاثة أيام .
2 - يختلف معامل المتصاص باختلاف درجات الحرارة ، فهو يضرب بالمعامل 0.76 عند درجة 25 درجة مئوية وبالمعامل 1.98
عند درجة 37 درجة مئوية .
3 - إذا كان معدل التغير فى شدة الامتصاص لا يزيد على 0.250 أو كانت درجة نشاط الأ نزيم أعلى من 700 وحدة دولية / لتر عند
30 درجة مئوية فإنة يجب إعادة التجربة مع تخفيف العينة بمحلول فيسيولوجى ( كلوريد الصوديوم 0.9% ) بمقدار خمس مرات .
تعليق